向日葵是菊科向日葵属的一年生草本植物，因花序随太阳转动而故名，向日葵种子叫葵花籽，可以作为零食，也可以油，且脂肪含量低是许多国家作为首选的植物油"，而油渣也能作为饲料利用，
       并且向日葵一身都是药，其种子、花盘、茎叶、茎髓、根、花等均可入药，具有很大的食用价值和经济价值。
       为了更好的培育向日葵，我们通过生物基因组学数据库对向日葵全基因组蛋白序列中含有的WRKY转录因子进行生物信息学分析，包括蛋白质基本理化性质、系统发育树、密码子偏好性等。开展了向日葵WRKY转录因子的染色体定位、保守元件的分析、外显子与内含子的分布情况和顺式作用元件的分析;进一步挖掘抗锈病相关基因。


       WRKY转录因子对向日葵的影响
       进一步通过Pfam分析确定向日葵WRKY转录因子存在的WRKY保守域，证明序列比对搜索的正确性，根据它们在向日葵基因组中的顺序，分别将其命名为HaWRKY1~HaWRKY127(表1)。研究表明，向日葵WRKY基因家族中氨基酸数目最大的是645(HaWRKY6)，氨基酸数目最小的是183(HaWRKY60)分子量在20781.84~74247.19，它们的等电点存在了很大的差异，HaWRKY49的PI是10.18为最大的等电点，HaWRKY113的PI是5.04为最小的等电点。
       其中大于7的有53个，小于7的有74个，说明这个家族的蛋白质更偏向于弱酸性。当不稳定系数小于40时，该蛋白为稳定蛋白，反之为不稳定蛋白。HaWRKY蛋白的不稳定系数为30.45~69.7，
       其中HaWRKY2、HaWRKY14、HaWRKY60、HaWRKY65、HaWRKY66、HaWRKY97、HaWRKY101、HaWRKY119和HaWRKY126为稳定蛋白，其余为不稳定蛋白;平均疏水性为负值，为亲水性蛋自。


       为了进一步分析向日葵HaWRKY家族的进化关系，利用127个向日葵HaWRKY蛋白构建进化树进行聚类分析，并根据其结构特征确定HaWRKY蛋白类型和分组情况。进化树结果(图1)显示，向日葵HaWRKY系统发育树分为类型1、Ⅱ和Ш，类型Ⅱ又分为Ⅱa、1b、Jc、1ld和Ie个亚组。类型Ш又分为Ia和Ib。其中，类型1、Ⅱ和I分别包括27、68和32个成员。
       通过NCBIBlast进行基因功能查询相似结构基因的功能，得出向日葵127条WRKY转录因子可能具有的功能，
       其中可能具有抗病功能的有62条只具有抗病功能的有12条，有抗寒功能的有17条，只具有抗寒功能的有4条，具有抗早功能的有30条。


       通过NCBIblast明确每条基因对应染色体及其位置，向日葵WRKY转录基因共127条，分别分布在所有34条染色体的1~17号染色体上，通过Maplnspect制作染色体定位分布图，
       结果表明，多数基因以基因的形式存在。其中10号染色体定位的基因数目最多，有18条基因。
       含有基因数目最少的是2号染色体，有两条基因，3、4和5号染色体定位的基因数目相同含有8条基因1、8和14号染色体定位的基因数目相同含有7条基因，7、12和13染色体定位的基因数目相同含有4条基因，9、15和16染色体定位的基因数目相同含有10条基因。


       利用序列分析软件DANMAN分析HaWRKY蛋白结构域结果表明，HaWRKY家族的WRKY结构域是高度保守的，其七肽域为WRKYGQK，锌指结构分别为C-X4-C-X23HXH、C-X5-C-X23HXH、C-X12-C-X23HXH，Ш组包括a、b两个亚组，其七肽域为WRKYGQK，锌指结构分别为包括C-X7-C-X23HXC和C-X10/11-CX24HXC，但是WRKY结构域中七肽域也会存在变异现象，变异为WRKYGEK、WKKYGEK、WRKYGKK和WKKYTHK。


       WRKY转录因子的密码子组成分析
       通过对127个HaWRKY转录因子的密码子使用情况分析，结果表明全基因组G+C含量为35.5%~50.5%，平均GC含量为41.8%。统计分析密码子第3个位置上的碱基类型，C、G的出现频率平均值分别是C3s为26.9%和G3s为23.9%，而A和T(U)的出现频率A3s为39.8%和T3s为36.4%。这些结果表明，向日葵WRKY转录因子所使用的A/T(U)结尾的密码子比重高于G/C结尾的密码子，向日葵基因组ENC平均值为53.96，说明向日葵密码子整体偏好性较弱。其中HaWRKY16、HaWRKY35和HaWRKY112这三个转录因子的ENC值为61，说明他们对密码子的选择性最低。


       CodonW软件用于计算并统计分析向日葵全基因组WRKY转录因子所有氨基酸对同义密码子的偏好性、使用频率等数据(表5)。密码子AGA的RSCU值最大为2.13，该密码子的偏好性最强;编码氨基酸Met，Trp中的AUG，UGG的RSCU值均等于1。
       表明向日葵WRKY转录因子中密码子AUG，UGG使用没有偏好性;氨基酸Arg中的密码子CGC的RSCU值为0.37，密码子偏好性最弱RSCU>1的密码子为高频密码子，共29个，且第3位为A、T、C和G的密码子数目分别占RSCU>1密码子总数的41.38%、44.82%、6.9%和6.9%。其中第3位为T的密码子数目最多，第3位为C和G的密码子最少，表明向日葵WRKY转录因子编码时偏好使用以AT(U)结尾的密码子，较少使用以C和G结尾的密码子。


       将向日葵全基因组WRKY转录因子序列按照ENC的大小进行排序，选取上限和下限区域的5%的序列数据形成高表达库和低表达库，再计算2个表达库中各个密码子的△RSCU值，选取高表达库中RSCU大于1而在低表达库中小于1，共鉴定出5个最优密码子，即AUA、GUG、CUC、GCA、AAC。


       通过绘制ENC与GC3s的相关性散点图，能有效地解释密码子的使用偏好性，可以反映在没有选择压力的情况下两者之间的关系。通过向日葵全基因组WRKY转录因子GC3s与ENC的关联性分析，大多数基因点均落在期望曲线附近，这说明碱基突变对密码子偏好性有很大影响，与期望曲线相距较远的是受自然选择压力较大。位于曲线下方的基因点，其ENC值相对较低，对应的内源基因表达量也相对越高，对密码子的使用具有更显著的偏好性;反之，处于曲线上方的基因点对密码子使用的选择性较低。


       密码子偏好性是翻译过程中重要调控参数，不同生物之间的密码子使用偏性也存在很大的差异…。绝大多数密码子的三个碱基在进化过程中都会发生突变，不同碱基的突变含义不同，前两个位置的碱基突变可以改变基因的功能为非同义突变，第三个碱基的突变多为同义密码子，不会影响基因功能;因此，分析第三位碱基的影响因素可能是揭示密码子偏好性的原因所在。
       向日葵WRKY转录因子的平均GC含量为41.80，大量结果表明，双子叶植物的GC含量通常低于50%，而单子叶植物的GC值往往较高，二者的密码子偏好性具有明显的差异"。从ENC-GC3s分布图中可以直接看出密码子的偏好性主要来自于碱基突变部分来自于自然选择压力。不同物种最优密码子的数目也不同，向日葵WRKY转录因子的最优密码子有5个，拟南芥和水稻的WRKY转录因子的最优密码子各有11个和27个。


       结语
       研究表明，WRKY转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫响应，在抗病信号通路中发挥着重要的作用。不同植物中WRKY转录因子数量不同，而WRKY转录因子在各种抗病信号通路中所起的作用也不尽相同，
       在辣椒中CaWRKY6与CaWRKY40促进了植物对青枯病菌的抗性…。
       AWRKY33过表达促进了拟南芥对灰霉病菌的抗性…，迄今为止，WRKY转录因子与向日葵锈病抗性的研究未见报道。为此，本文对向日葵抗性相关转录因子WRKY进行了筛选和研究，选出13个代表性基因检测其是否与锈病抗性的相关。荧光定量PCR结果显示，有11个基因在抗锈病品种中是上调的，表明这11个基因很可能在抗病反应中起到重要作用;有2个下调的，表明这2个基因可能在抗病反应中起到负调控的作用。


       通过对向日葵WRKY转录因子进行生物信息学分析与挑选，利用荧光定量PCR技术分析了13个基因的表达量。结果表明，其中有11个基因在抗病品种中的表达量均高于感病品种。HaWRKY25表达量在所有基因中抗感病表达量为最高。尽管抗病与感病品种之间的基因表达存在差异，但是抗病反应中的表达量都明显高于感病反应中的表达量，
       并且在向日葵HAR5和黑大片上都有明显的的褪绿斑，这11个基因在抗病反应中可能发挥着重要作用。